Una zoonosis es una enfermedad que puede ser transmitida de animales a humanos. Este estudio se enfoca en Brucella abortus el cual es un patógeno zoonótico que causa abortos e infertilidad en el ganado vacuno y puede tener implicaciones muy fuertes en países cuyas economías tienen gran dependencia en la industra ganadera, o en general es problemática para todas las familias que dependen de esta actividad económica. Por eso esta investigación se enfoca en conocer el comportamiento del patógeno.
La patogénesis u origen y desarrollo de esta enfermedad está vinculado con su capacidad para entrar, transitar y multiplicarse dentro de las células hospederas. Para que la multiplicación del patógeno en las células sea exitoso deben existir 2 sistemas moleculares
- (TCS) BvrR/BvrS: actúa como un regulador global que afecta la expresión de una gran variedad de genes y factores de transcripción importantes para la transición entre la vida extra e intracelular. (Rivas-Solano; 2015)
- Sistema de secreción tipo IV (T4SS) VirB: que están implicados en la traslocación de efectores de virulencia a la célula hospedera. (Un efector suele ser una molécula pequeña que se une selectivamente a una proteína y regula su actividad biológica)
(Para conocer los resultados de la investigación haga click aquí)
Para conocer los mecanismos moleculares de adaptación a la vida intracelular de Brucella abortus se planteó esta investigación con 3 objetivos.
I Objetivo: Determinar la activación del TCS BvrR.
Este objetivo se desarrolló mediante 3 metas.
- Purificación de BvrS y BvrR recombinantes.
- Reacción de fosforilación In vitro.
- Reacciones de fosforilación ex vivo.
II Objetivo: Medir la activación y ensamblaje del T4SS VirB.
*(VirB: regulador de transcripción del código genético del patógeno)
Para resolver este objetivo también, al igual que en el anterior se dividió en 3 metas que administraran la obtención de la información requerida.
- Expresión y purificación de VJBR, VIRB1, VIRB2, VIRB5, VIRB8 Y VIRB9.
- Expresión In vitro de VirB (T4SS) en B. abortus 2308 y en mutantes BVRR / BVRS.
- Expresión In vitro de proteínas VirB, VJBR y ensamblaje del mecanismo de secreción.
III Objetivo: Analizar la expresión de VirB y VjbR en mutantes del TCS BvrRS
Este último objetivo se desarrolló con tan solo una meta. La cual consistió en analizar la expresión de VirB y VjbR en mutantes del TCS BvrRS
Resultados
Resultado: Objetivo I
Se implementó un protocolo para determinar la activación del sistema de dos componentes basado en cromatografía phos-tag. Se purificaron BvrR y BvrS en forma recombinante. Se trabajó implementando y midiendo la reacción de fosforilación en bacterias intactas y extraídas de condiciones intracelulares.
También se determinó que el sistema de dos componentes es activado por condiciones limitantes de nutrientes y acidez. Esto se determinó tanto in vitro como ex vivo en el interior de células eucariotas.
Resultado: Objetivo II
Se purificó VjbR y VirB8. Se estandarizó un western-blot para determinar los niveles de VirB en bacterias extracelulares e intracelulares.
‘’Western-blot’’ es una técnica usada comúnmente para realizar la separación e identificación de proteínas.
Al mismo tiempo, se determinó que VirB y VjbR se producen en mayor cantidad cuando las bacterias se encuentran intracelularmente. También encontramos que VirB8 forma un dímero cuando la bacteria está intracelular.
Resultado: Objetivo III
Se determinó que VirB y VjbR están disminuidas en mutantes del sistema BvrRS. Se determinó que BvrS se une directamente al promotor de VjbR y del sistema de secreción IV VirB.
Gracias a la información descubierta a raíz de esta investigación conocemos mucho más del comportamiento de la bacteria Brucella abortus. Gracias al conocimiento adquirido estamos un paso más cerca de poder erradicar la problemática que causa esta bacteria en la industria ganadera. Gran cantidad de familias que viven del negocio ganadero se ven beneficiadas con la investigación realizada.